ORDIN nr.471 din 10 octombrie 2002
al ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea şi confirmarea prezenţei septicemiei hemoragice virale - SHV - şi necrozei hematopoetice infecţioase - NHI - la peşti
Textul actului publicat în M.Of. nr. 857/27 noi. 2002

În temeiul prevederilor art. 31 alin. 1 din Legea sanitară veterinară nr. 60/1974, republicată, cu modificările şi completările ulterioare,
în baza Hotărârii Guvernului nr.362/2002 privind organizarea şi funcţionarea Ministerului Agriculturii, Alimentaţiei şi Pădurilor, cu modificările şi completările ulterioare,
văzând Referatul de aprobare nr. 159.465 din 16 septembrie 2002, întocmit de Agenţia Naţională Sanitară Veterinară,
ministrul agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor
emite următorul ordin:

Art. 1. - Se aprobă Norma sanitară veterinară privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea şi confirmarea prezenţei septicemiei hemoragice virale SHV - şi necrozei hematopoetice infecţioase - NHI - la peşti, prevăzută în anexa care face parte integrantă din prezentul ordin.

Art. 2. - Agenţia Naţională Sanitară Veterinară, institutele centrale de profil şi direcţiile sanitare veterinare judeţene şi a municipiului Bucureşti vor aduce la îndeplinire prevederile prezentului ordin.

Art. 3. - Agenţia Naţională Sanitară Veterinară va controla modul de aplicare a prevederilor prezentului ordin.

Art. 4. - La data intrării în vigoare a prezentului ordin se abrogă orice altă dispoziţie contrară.

Art. 5. - Prezentul ordin va fi publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I.

Ministrul agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor,
Ilie Sârbu

Bucureşti, 10 octombrie 2002.
Nr. 471.

ANEXĂ

NORMĂ SANITARĂ VETERINARĂ
privind planurile de prelevare, metodele de diagnostic, determinarea şi confirmarea prezenţei septicemiei hemoragice virale - SHV - şi necrozei hematopoetice infecţioase - NHI - la peşti

PREVEDERI GENERALE

Art. 1. - În sensul prezentei norme sanitare veterinare, se prevăd:

a) liniile directoare şi reglementările minime care se aplică planurilor de prelevare şi metodelor de diagnostic pentru detectarea şi confirmarea prezenţei septicemiei hemoragice virale - SHV - şi necrozei hematopoetice infecţioase - NHI;
b) integrarea dispoziţiilor Ordinului ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr. 494/2001 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind condiţiile de sănătate a animalelor, care reglementează punerea pe piaţă a animalelor şi a produselor de acvacultură, publicat în Monitorul Oficial al României, Partea I, nr.191 din 21 martie 2002, cu privire la agrearea şi menţinerea agreării zonei şi a unităţilor în zonele neagreate;
c) stabilirea dispoziţiilor care vizează diagnosticul corect al SHV şi NHI şi recunoaşterea oficială a statutului de zonă agreată şi unitate agreată în zonă neagreată, în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.494/2001;
d) stabilirea conduitei autorităţilor responsabile cu controlul SHV şi NHI şi personalului de laborator care realizează testele pentru aceste boli. În consecinţă, accentul este pus pe procedurile de prelevare, principiile şi aplicaţiile testelor de laborator şi evaluarea rezultatului acestora, precum şi pe tehnicile de laborator în detaliu. Totuşi, la nevoie, laboratoarele pot să aducă modificări la testele descrise în această anexă sau să utilizeze teste diferite, cu condiţia să fie dovedite o sensibilitate şi o specificitate echivalente. Partea I cuprinde planurile de prelevare şi metodele de diagnostic pentru supravegherea SHV şi NHI cu scopul de a obţine menţinerea statusului de zonă agreată sau unitate agreată în zonă neagreată. Partea a II-a descrie procedeele de diagnostic pentru confirmarea SHV şi NHI în caz de suspiciune. Partea a III-a cuprinde criteriile şi liniile directoare aplicabile unui program de inspecţie sanitară veterinară oficială care să dovedească absenţa anterioară a SHV şi/sau NHI. Partea a IV-a furnizează recomandări asupra procedurilor de titrare a virusurilor NHI şi SHV în scopul verificării sensibilităţii culturilor celulare la infecţie. În partea a V-a sunt enumerate acronimele şi abrevierile.

PARTEA I
Planurile de prelevare şi metodele de diagnostic pentru supravegherea septicemiei hemoragice virale - SHV - şi necrozei hematopoetice infecţioase - NHI - la peşti pentru obţinerea şi menţinerea agreării unei zone sau unei unităţi dintr-o zonă neagreată

CAPITOLUL I
Inspecţii şi prelevare

Art. 2. - Dispoziţii generale relative la inspecţiile sanitare veterinare clinice, la colectarea şi selecţionarea probelor pentru supravegherea zonelor sau unităţilor situate în zone neagreate, în scopul obţinerii sau menţinerii agreării pentru SHV şi/sau NHI

a) Inspecţiile sanitare veterinare clinice şi prelevările de ţesuturi de peşte şi/sau lichid ovarian se efectuează în zone sau unităţi situate în zone neagreate, în vederea obţinerii sau menţinerii agreării pentru SHV şi/sau NHI, în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.494/2001. Alte detalii sunt prezentate în art. 3-5. Schemele de inspecţie şi recoltare prevăzute în anexele nr. 1 şi 2 nu se aplică unor unităţi noi sau unităţilor care acum încep activitatea cu peşte, icre sau lapţi care provin din zone agreate sau din unităţi agreate situate în zone neagreate, cu condiţia ca ele să îndeplinească cerinţele prevăzute în Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.494/2001.
b) Inspecţiile clinice trebuie să fie efectuate în cursul perioadei cuprinse între lunile octombrie şi iunie sau când temperatura apei este inferioară celei de 14oC. Atunci când unităţile trebuie să facă obiectul unei inspecţii clinice de două ori pe an, intervalele dintre inspecţii trebuie să fie de cel puţin 4 luni. Toate unităţile de producţie (bazine, cuve, viviere etc.) trebuie să fie supuse unei inspecţii destinate să stabilească prezenţa de peşti morţi, agonici sau cu comportament anormal. O atenţie particulară trebuie să fie acordată punctului de evacuare a apei, unde peştii agonici au tendinţa să se acumuleze în curentul de apă.
c) Peştii care se prelevează sunt selecţionaţi după cum urmează:

1. dacă sunt prezenţi păstrăvi curcubeu, singurii care se prelevează sunt aceştia; dacă aceştia nu sunt prezenţi, prelevarea se compune din toate speciile prezente, în măsura în care aceste specii sunt sensibile la virusurile SHV şi/sau NHI şi în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.494/2001; în probă speciile trebuie să fie reprezentate proporţional;

2. dacă mai mult de o sursă de apă este utilizată pentru producţia de peşte, în proba prelevată trebuie să fie incluşi peştii care să reprezinte toate sursele de apă;

3. dacă sunt peşti în agonie, cu comportament anormal sau peşti morţi recent, dar nu descompuşi, aceştia trebuie selecţionaţi în primul rând; dacă aceşti peşti nu sunt prezenţi, proba prelevată trebuie să fie compusă din peşti cu aspect anormal, aparent sănătoşi, din toate zonele din unitate, astfel ca toate clasele de vârstă să fie reprezentate proporţional în probă.

Art. 3. - Dispoziţii specifice, incluzând colectarea probelor, relative la supravegherea zonelor sau unităţilor din zonele neagreate, în scopul obţinerii agreării pentru SHV şi/sau NHI

a) O zonă sau o exploataţie dintr-o zonă neagreată, plasată sub controlul serviciilor sanitare veterinare, poate obţine agrearea pentru SHV şi/sau NHI cu condiţia să se supună unuia dintre următoarele două programe:

1. Modelul A - Program de supraveghere pentru 2 ani. După cel puţin 2 ani de absenţă a unui semn clinic de SHV şi/sau NHI, toate unităţile dintr-o zonă sau orice unitate dintr-o zonă neagreată destinată agreării trebuie să facă obiectul unei inspecţii sanitare veterinare de două ori pe an, timp de 2 ani. În timpul acestei perioade de control de 2 ani care precede obţinerea agreării, absenţa oricărui semn clinic de SHV şi/sau NHI trebuie să fie continuă, iar prelevările de probe să se efectueze în conformitate cu anexa nr. 1. În plus, probele trebuie să fie selecţionate, prelucrate şi examinate conform dispoziţiilor art. 2-5, iar examenele de laborator trebuie să fie negative pentru SHV şi/sau NHI; sau
2. Modelul B - Program de supraveghere pentru 2 ani, cu o mărime redusă a probei prelevate. Ca urmare a unui program de inspecţii sanitare veterinare oficiale care poate dovedi absenţa SHV şi/sau NHI pentru cel puţin 4 ani, toate unităţile din zonă sau orice unitate dintr-o zonă neagreată, destinată agreării, trebuie să facă obiectul unei inspecţii sanitare veterinare de două ori pe an, timp de 2 ani.

În cursul acestei perioade care precedă obţinerea agreării, absenţa semnelor clinice sau a altor semne de SHV şi/sau NHI trebuie să fie continuă, iar probele se prelevează pentru examen în conformitate cu anexa nr. 2. În plus, prelevările trebuie să fie selecţionate, pregătite şi examinate conform dispoziţiilor art. 2-5, iar examenele de laborator să fie negative pentru SHV şi/sau NHI.

Pentru ca un program de inspecţii sanitare veterinare să fie recunoscut de către serviciile sanitare oficiale ca făcând dovada absenţei anterioare a SHV şi/sau NHI, trebuie să îndeplinească şi să respecte criteriile stabilite în partea a III-a.

b) Dispoziţii speciale sunt aplicabile în unităţile nouagreate şi în unităţile care încep activitatea cu peşti, icre sau lapţi provenind dintr-o zonă agreată sau dintr-o unitate agreată dintr-o zonă neagreată.

Unităţile noi sau unităţile care îşi încep activitatea cu peşti, icre sau lapţi provenind dintr-o zonă agreată sau unitate agreată din zonă neagreată pot obţine agrearea în conformitate cu Ordinul ministrului agriculturii, alimentaţiei şi pădurilor nr.494/2001. În consecinţă, dispoziţiile de prelevare sunt stabilite în conformitate cu modelele A şi B prevăzute la lit. a) de mai sus.

Art. 4. - Program de supraveghere pentru menţinerea agreării pentru SHV şi/sau NHI În scopul menţinerii agreării într-o zonă sau într-o unitate dintr-o zonă neagreată pentru SHV şi/sau NHI, inspecţiile şi prelevarea probelor pentru examen trebuie să se efectueze în conformitate cu anexa nr. 3. Probele trebuie să fie selecţionate, pregătite şi examinate în conformitate cu dispoziţiile art. 2-5, iar rezultatele examenelor de laborator să fie negative pentru SHV şi/sau NHI.

Art. 5. - Pregătirea şi expedierea probelor de peşte

a) Înainte de a fi expediate sau transferate către laborator, se prelevează de la peşti organe sau fragmente de organe cu ajutorul instrumentelor de disecţie şi se transferă în tub de plastic steril conţinând mediu de transport mediu de culturi celulare cu 10% ser fetal bovin şi antibiotice. Se recomandă combinaţia de 200 UI penicilină, 200 žg streptomicină şi 200 žg kanamicină/ml, dar în aceeaşi măsură pot fi utilizate şi alte antibiotice cu eficacitate demonstrată. Ţesuturile pentru examinat sunt splina, rinichiul anterior şi, după caz, cordul sau encefalul. În anumite cazuri trebuie examinat lichidul ovarian, în conformitate cu anexele nr. 1-3. Lichidul ovarian sau fragmente de organe de la maximum 10 peşti - anexele nr. 1-3 pot fi comasate într-un tub steril conţinând 4 ml mediu de transport şi care să reprezinte un eşantion (pool) global. Ţesuturile din fiecare pool trebuie să fie în cantitate de cel puţin 0,5 g.
b) Tuburile cu probe se introduc într-un recipient izolat, de exemplu o cutie de polistiren cu pereţii groşi, cu o cantitate suficientă de gheaţă, care să garanteze refrigerarea probelor pe timpul transportului până la laborator. Trebuie evitată congelarea probelor. Temperatura probei pe timpul transportului nu trebuie să depăşească 10oC, recipientul de transport trebuie să mai conţină gheaţă când ajunge la destinaţie, iar blocul refrigerator trebuie să fie parţial sau total congelat.
c) Examenul virusologic trebuie să înceapă imediat sau cât mai curând posibil, cel târziu în 48 de ore de la prelevarea probelor. În cazuri excepţionale, de exemplu atunci când peştii provin din zone îndepărtate, fără posibilitate de expediere zilnică, examenul virusologic poate fi efectuat în 72 de ore de la colectarea materialului de examinat, cu condiţia ca acesta să fie protejat cu mediu de transport, iar condiţiile de temperatură pe timpul transportului să fie cele indicate mai sus. Se pot expedia şi peşti vii. Condiţiile de ambalare şi etichetare trebuie să respecte reglementările naţionale sau internaţionale în vigoare în materie de transport, dacă este cazul.

Art. 6. - Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic De comun acord cu Institutul de Diagnostic şi Sănătate Animală, şi alte probe pot fi colectate şi pregătite în vederea examenelor suplimentare.

CAPITOLUL II
Prepararea probelor în vederea examenului virusologic

Art. 7. - Congelarea în cazuri excepţionale Dacă există dificultăţi obiective, precum condiţii climaterice defavorabile, zile nelucrătoare, probleme de laborator, care împiedică inocularea celulelor în primele 48 de ore de la colectarea probelor de ţesut, este admis ca probele să fie congelate în mediu de cultură la -20oC sau la o temperatură inferioară, iar examenul virusologic să se efectueze într-o perioadă de 14 zile. Totuşi proba nu poate fi congelată şi decongelată decât o singură dată înaintea examinării. Este necesar să se ţină un registru în care să fie menţionate cauzele fiecărei congelări a probelor de ţesut, de exemplu furtuni, linii celulare moarte etc.

Art. 8. - Omogenizarea organelor În laborator, ţesuturile trebuie să fie complet omogenizate cu ajutorul unui stomaker sau cu mojar şi nisip steril, după care produsul se introduce în mediul de transport original. Dacă proba este compusă din peşti întregi mai mici de 4 cm lungime, aceştia se fragmentează cu foarfecele steril după ce se elimină coada din spatele anusului. Dacă proba este constituită din peşti cu dimensiuni de 4-6 cm, se colectează viscerele şi rinichiul. Dacă peştii sunt mai mari de 6 cm, ţesuturile se recoltează conform prevederilor cap. I art. 4. Probele de ţesut se reduc la fragmente mici cu ajutorul foarfecelui steril sau bisturiului, se omogenizează şi se introduc în mediul de transport, aşa cum s-a menţionat mai sus. Raportul final între materialul tisular şi mediul de transport trebuie să fie de 1:10.

Art. 9. - Centrifugarea omogenatului

a) Omogenatul este centrifugat în centrifugă cu răcire, la o temperatură cuprinsă între 2-5oC la 2.000-4.000 x g, timp de 15 minute, iar lichidul supernatant este colectat şi tratat, fie 4 ore la 15oC, fie peste noapte la 4oC, cu antibiotice; de exemplu, 1 mg gentamicină/ml poate fi foarte util în acest stadiu. Dacă proba a fost expediată în mediu de transport - adică sub antibiotic -, tratamentul lichidului supernatant nu mai este necesar. Tratamentul cu antibiotic vizează împiedicarea contaminării bacteriene a probei şi face inutilă filtrarea prin filtru cu membrană. Dacă lichidul supernatant colectat este congelat la -80oC în curs de 48 de ore de la prelevarea probei, acesta poate fi utilizat o singură dată pentru examen virusologic.
b) Dacă există dificultăţi obiective - incubator defect, probleme cu mediile de cultură celulare - care împiedică inocularea celulelor în primele 48 de ore de la prelevarea probelor de ţesut, este admis ca lichidul supernatant să fie congelat la -80oC, iar examenul virusologic să fie executat în maximum 14 zile. Înainte de a inocula celulele, se amestecă supernatantul cu părţi egale cu un pool de antiser contra serotipurilor indigene de virus al necrozei pancreatice infecţioase - NPI -, diluat într-o manieră adecvată şi incubat timp de minimum o oră la 15oC sau maximum 18 ore la 4oC. Titrul antiserului trebuie să fie cel puţin 1/2.000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50% reducerea plajelor. Tratamentul efectuat prin inocularea cu ser antivirus NPI la culturile celulare - virus care în anumite regiuni din Europa este prezent în 50% din probele de peşte - vizează împiedicarea apariţiei unui efect citopatic dat de NPI în respectivele culturi celulare. Acest tratament permite reducerea duratei examenului virusologic, astfel ca numărul de cazuri în care apare efectul citopatic să fie considerat ca un indicator potenţial de SHV şi/sau NHI. Atunci când probele provin dintr-o unitate considerată indemnă la NPI, tratamentul cu ser antivirus NPI poate fi omis.

CAPITOLUL III
Examinarea virusologică

Art. 10. - Culturile celulare şi mediile de cultură

a) Linii celulare Bluegill fry - BF2 - sau Rainbow trout gonad - RTG2 - şi Epithelioma papulosum cyprini EPC - sau Fathead minnow - FHM - sunt crescute la temperaturi de 20-30oC în mediu corespunzător, de exemplu EagleŐs MEM sau modificări ale acestuia, cu un supliment de ser fetal bovin de 10% şi antibiotice în concentraţii standard.
b) Când celulele sunt cultivate în sisteme închise, este recomandat ca mediul să fie tamponat cu bicarbonat de sodiu. Mediul folosit pentru cultivarea celulelor în sisteme deschise poate fi tamponat cu Trishidroximetil aminometan Tris-HCI, 23 mM şi bicarbonat de sodiu, 6 mM; pH-ul trebuie să fie 7,6 š 0,2.
c) Culturile celulare folosite pentru inocularea cu omogenat de ţesuturi trebuie să fie tinere, 4-48 de ore, şi în faza de creştere, neconfluente, la inoculare.

Art. 11. - Inocularea culturilor celulare

a) Suspensia de organe tratată cu antibiotice este inoculată pe culturi celulare în două diluţii, de exemplu diluţia primară şi în plus o diluţie de 1:10 din aceasta, rezultând diluţii finale ale omogenatului de organe în mediul de culturi celulare de 1:100 şi, respectiv, 1:1.000, în scopul prevenirii interferenţei omologilor. Cel puţin două linii celulare trebuie să fie inoculate în conformitate cu prevederile art. 10 lit. a). Raportul dintre volumul inoculului - suspensia de organe tratată cu antibiotice - şi volumul mediului de culturi celulare trebuie să fie de aproximativ 1:10.
b) Pentru fiecare diluţie şi fiecare linie celulară trebuie să fie utilizată o suprafaţă de aproximativ 2 cm2, corespunzând unui godeu dintr-o placă cu 24 de godeuri. Folosirea plăcuţelor cu godeuri este recomandată, dar sunt acceptate, de asemenea, şi alte suporturi cu suprafaţă de creştere similară sau mai mare.

Art. 12. - Incubarea culturilor celulare

a) Culturile celulare inoculate sunt incubate la temperatura de 15oC pentru 7-10 zile. Dacă culoarea mediului culturilor celulare virează de la roşu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se va ajusta pH-ul mediului cu soluţie sterilă de bicarbonat de sodiu sau substanţe echivalente, pentru a asigura susceptibilitatea culturii celulare la infecţie.
b) La fiecare 6 luni sau dacă este suspectată scăderea susceptibilităţii celulare, se va efectua calcularea titrului stocurilor de virusuri îngheţate pentru SHV şi NHI, pentru a verifica susceptibilitatea culturilor celulare la infecţie. O procedură recomandată este prezentată în partea a IV-a.

Art. 13. - Microscopia Culturile celulare inoculate trebuie să fie inspectate zilnic sau cel puţin de trei ori pe săptămână, cu scopul de a urmări apariţia efectului citopatic, cu un grosisment între 40 x la 150 x. Dacă efectul citopatic este evident, se începe imediat procedura de identificare a virusului în conformitate cu partea I cap. IV.

Art. 14. - Subcultivarea

a) Dacă nu se produce nici un efect citopatic în prima incubaţie de 7-10 zile, se procedează la o subcultivare pe culturi celulare proaspete, utilizându-se o suprafaţă celulară similară cu cea din cultura primară.
b) Cantitatea de mediu - lichid supernatant - care provine din toate culturile/godeurile ce constituie cultura primară este adunată într-un pool pentru fiecare linie celulară, la 7-10 zile după inoculare. Eşantioanele - pool-urile sunt apoi inoculate pe culturi celulare omoloage, nediluat şi diluat 1/10, rezultând în final diluţii ale supernatantului de 1:10 şi 1:100, astfel cum este descris în art. 11. Părţi de 10% din mediul ce constituie cultura primară sunt inoculate direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete, subcultivare godeu la godeu. Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluţiilor cu antiser contra virusului NPI în diluţii corespunzătoare, în conformitate cu cap. II art. 9.
c) Incubarea următoare, timp de 7-10 zile la 15oC, se face în conformitate cu art. 12.
d) Dacă se produce un efect citopatic toxic în primele 3 zile de incubaţie, se poate realiza o subcultivare în acest stadiu, dar celulele trebuie să fie incubate 7 zile, urmată de o subcultivare cu durata de incubaţie tot de 7 zile. Atunci când se produce un efect citopatic toxic după 3 zile, celulele pot fi pasate o dată şi incubate pentru a obţine un total de 14 zile de la prima inoculare. Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor 7 zile de incubaţie.
e) Dacă se produce o contaminare bacteriană în ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie precedată de o centrifugare la 2.000-4.000 x g timp de 15-30 de minute, la temperatura de 2-5oC, şi/sau de o filtrare a supernatantului cu un filtru - membrană cu procent scăzut de absorbţie a proteinei - de 0,45 žm. În plus faţă de acest aspect, procedurile de subcultivare sunt aceleaşi ca şi cele care se aplică în cazul apariţiei efectului citopatic toxic.

CAPITOLUL IV
Identificarea virusului

Art. 15. - Teste de identificare virală Dacă se observă apariţia de efect citopatic în culturile celulare, mediul de cultură - supernatantul - este colectat şi examinat prin una dintre următoarele tehnici: neutralizare, imunofluorescenţă, ELISA.

Dacă prin aceste teste nu se definitivează identificarea virusului într-o săptămână, supernatantul trebuie să fie trimis la un laborator naţional de referinţă sau la laboratorul de referinţă al Uniunii Europene pentru bolile peştilor, în vederea identificării imediate.

Art. 16. - Neutralizarea

a) Se îndepărtează celulele din supernatantul colectat, prin centrifugare la 2.000-4.000 x g sau filtrare prin membrană de 0,45 žm cu procent scăzut de absorbţie a proteinelor, şi se diluează supernatantul 1:100 şi 1:10.000 în mediu de culturi celulare.
b) Părţi din cele două diluţii ale supernatantului sunt amestecate separat şi incubate pentru 60 de minute la 15oC cu părţi egale din următorii reagenţi:
1. ser ce conţine anticorpi anti virusul SHV la diluţie 1:50, vol:vol;
2. ser ce conţine anticorpi anti virusul IHN la diluţie 1:50, vol:vol;
3. pool de antiser anti serotipurile indigene la virusul IPN la diluţie 1:50, vol:vol;
4. doar mediu - martor pozitiv.
c) 50 žl din fiecare amestec format din supernatantul cu virusul de identificat şi ser se inoculează pe cel puţin două culturi celulare şi se incubează la 15oC. Se urmăreşte apariţia efectului citopatic aşa cum este descris în art. 13.
d) Unele tulpini de virus SHV nu reacţionează la testele de neutralizare. Astfel de izolate trebuie să fie identificate prin imunofluorescenţă - IF - sau ELISA.
e) Pot fi utilizate alternativ şi alte teste de neutralizare cu eficienţă dovedită.

Art. 17. - Imunofluorescenţa - IF

a) Pentru fiecare izolat viral care trebuie să fie identificat este necesar să se cultive cel puţin 8 lamele sau echivalentul, cu celule la o densitate care să asigure o confluenţă de aproximativ 60-90% după 24 ore de la cultivare. Linia celulară EPC este recomandată pentru acest scop datorită aderenţei sale puternice la suprafeţele de sticlă, dar pot fi folosite, de asemenea, şi alte linii celulare cum sunt BF2, RTG2 sau FHM.
b) Virusul care trebuie să fie identificat se inoculează când celulele s-au prins pe suprafaţa de sticlă, la aproximativ o oră după tripsinizare, sau când culturile au fost incubate până la 24 ore. Patru culturi sunt inoculate la un raport volum la volum de 1:10 şi patru culturi la un raport de 1:1.000. Acestea sunt apoi incubate la 15oC pentru 20-30 de ore.
c) După incubaţie, culturile sunt clătite de două ori în mediu EagleŐs MEM fără ser fetal, se fixează în 80% acetonă rece şi se colorează apoi prin tehnica de imunofluorescenţă indirectă - IFAT. Primul strat de reagent este reprezentat de anticorpi monoclonali sau policlonali la o calitate de referinţă. Al doilea strat de reagent este reprezentat de un antiser - antiimunoglobulinele utilizate în primul strat -, conjugat cu fluorocrom. Pentru fiecare dintre antiserurile testate se utilizează cel puţin o cultură inoculată cu doză crescută şi o cultură inoculată cu doză scăzută. Este necesară includerea în test a martorilor pozitivi şi negativi. Este recomandată folosirea fluorocromilor fluorescein izotiocianat - FITC - sau tetrametil-rodamin-izotiocianat - TRITC.
d) Lamelele cu culturi celulare tratate cu reagenţii de mai sus se montează în glicerol salin. Se examinează la microscop cu sursă de lumină ultravioletă - UV. Se utilizează oculare de 10 x sau 12 x şi obiective de x 25 sau x 40 cu apertura mai mare de 0,7 şi, respectiv, de 1,3.
e) Tehnica de IF descrisă mai sus este un exemplu. Pot fi aplicate şi alte tehnici de IF a căror eficacitate a fost dovedită: culturi celulare, fixare şi anticorpi de referinţă.

Art. 18. - ELISA

a) Godeurile din placa de microtitrare sunt căptuşite peste noapte cu diluţii stabilite de fracţiuni de imunoglobuline purificate provenite din seruri de referinţă.
b) După spălarea godeurilor cu tampon fosfat salin PBS-Tween 20, virusul care trebuie identificat este pipetat în godeuri în trepte de diluţie din 2 în 2 sau din 4 în 4 şi se lasă să reacţioneze cu anticorpii ce căptuşesc placa, timp de 60 de minute la 37oC. După spălare cu tampon PBS-Tween 20, sunt adăugaţi anticorpii a căror specificitate corespunde cu cea a anticorpilor ce căptuşesc godeurile şi se lasă să reacţioneze 60 de minute la 20oC. După o altă spălare ca mai sus se adaugă streptavidin conjugat cu peroxidază din hrean - HRP - şi se lasă să reacţioneze pentru o oră la 20oC. După ultima spălare, enzima legată este vizualizată folosindu-se un substrat ELISA corespunzător.
c) Reacţia ELISA de mai sus cu biotină-avidină este un exemplu. Pot fi folosite şi alte tipuri de ELISA cu eficienţă dovedită.

PARTEA a II-a
Procedurile de diagnostic pentru confirmarea SHV şi NHI în episoadele de boală

Art. 19. - Una sau mai multe dintre următoarele tehnici trebuie să fie efectuate pentru diagnosticul SHV şi NHI:

A. izolare virală cu identificare serologică ulterioară;

B. izolare virală cu identificare serologică simultană;

C. alte tehnici de diagnostic (IFAT, ELISA).

Art. 20. - Confirmarea pentru prima dată a SHV sau NHI în ferme din zone agreate nu trebuie efectuată numai prin metoda C. Trebuie folosită, de asemenea, ori metoda A ori B.

Art. 21. - Probele de organe destinate examenului virusologic trebuie să fie însoţite în anumite cazuri de material suplimentar în vederea efectuării examenelor bacteriologic, parazitologic, histologic sau a altor examene necesare diagnosticului diferenţial.

A. Izolare virală cu identificare serologică ulterioară

1. a) Selecţia probelor: cel puţin 10 peşti ce prezintă semne tipice de NHI sau SHV trebuie să fie selectaţi pentru examinare.

b) Pregătirea şi expedierea probelor de peşte: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 5.
c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 6.

2. Prepararea probelor în vederea examinării virusologice: astfel cum este prevăzut în partea I cap. II.

3. Examinarea virusologică: astfel cum este prevăzut în partea I cap. III.

4. Identificarea virusului: astfel cum este prevăzut în partea I cap. IV.

B. Izolare virală cu identificare serologică simultană

1. a) Selecţia probelor: aşa cum este prevăzut la lit. A pct. 1 lit. a).

b) Pregătirea şi expedierea probelor de peşte: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 5.
c) Colectarea de material suplimentar pentru diagnostic: astfel cum este prevăzut în partea I cap. I art. 6.

2. a) Omogenizarea organelor: astfel cum este prevăzut în partea I cap. II art. 8.

b) Centrifugarea omogenatului: omogenatul este centrifugat într-o centrifugă cu răcire la 2-5oC, la 2.000-4.000 x g, timp de 15 minute, iar supernatantul este colectat şi tratat pentru 4 ore la 15oC cu antibiotice, de exemplu gentamicină 1mg/ml, sau filtrat prin membrană de 0,45 žm, cu procent scăzut de legare a proteinei.
c) Tratarea supernatantului cu antiser: suspensia de organe tratată cu antibiotice sau filtrată este diluată 1:10 şi 1:1000 în mediu de culturi celulare, iar părţi din acesta se amestecă şi se incubează 60 de minute la 15oC cu părţi egale din reagenţii menţionaţi în partea I cap. IV art. 16.

3. a) Culturile celulare şi mediile de cultură: astfel cum sunt prevăzute în partea I cap. III art. 10;

b) Inocularea culturilor de celule: cel puţin două linii celulare sunt inoculate cu 50 žl din fiecare amestec virus-ser (preparat astfel cum este prevăzut la pct. 2 de mai sus).
c) Incubarea culturilor celulare: astfel cum este prevăzută în partea I cap. III art. 12.
d) Microscopie
- culturile celulare inoculate sunt controlate zilnic la microscop, pentru verificarea apariţiei efectului citopatic, la o mărire de la 40 x la 150 x. Dacă efectul citopatic este împiedicat să apară de unul din antiserurile folosite, virusul poate fi considerat a fi identificat corespunzător;
- dacă nici unul dintre antiserurile folosite nu împiedică apariţia efectului citopatic, se procedează la identificarea virusului în conformitate cu cele prezentate în partea I cap. IV.
e) Subcultivarea: dacă nu se produce nici un efect citopatic în 7-10 zile, se procedează la o subcultivare plecând de la culturi inoculate cu lichid supernatant şi mediu în conformitate cu lit. B pct. 2 c) şi partea I cap. III art. 14.

C. Alte tehnici de diagnostic

1. Lichidul supernatant preparat astfel cum este indicat în partea I cap. II art. 9 poate fi supus unor tehnici de IFAT sau ELISA, în conformitate cu partea I cap. IV art. 17-18.

2. Aceste tehnici rapide trebuie să fie completate printr-un examen virusologic în 48 de ore după prelevare, în conformitate cu lit. A sau B, dacă:

a) a fost obţinut un rezultat negativ; sau
b) a fost obţinut un rezultat negativ de la o prelevare reprezentând primul caz de NHI sau SHV într-o zonă agreată.

3. Materialul tisular poate fi supus şi altor tehnici de diagnostic cum ar fi RT-PCR, IF pe secţiuni congelate sau imunohistochimie pe material tisular fixat în formol.

4. Aceste tehnici trebuie să fie întotdeauna însoţite de inoculare pe culturi celulare de material tisular nefixat.

PARTEA a III-a
Demonstrarea absenţei anterioare de SHV şi/sau NHI în zone sau ferme din zone neagreate

Art. 22. - Linii directoare şi criterii care se aplică unui program de inspecţii sanitare veterinare oficiale

(1) Un program de inspecţii sanitare veterinare poate fi pus în aplicare doar în următoarele situaţii:

a) după un program de eradicare a SHV şi/sau NHI recunoscut oficial, care să cuprindă eliminarea tuturor peştilor din unitate, curăţenie mecanică, dezinfecţie şi lăsarea pe uscat înainte de repopularea cu peşti din unităţi agreate; sau
b) în unităţi piscicole în care nu a evoluat anterior nici o infecţie legată de virusul SHV sau NHI.

(2) Programul de inspecţii sanitare veterinare oficiale trebuie să se bazeze pe examinări clinice şi examene de laborator.

(3) Programul trebuie să cuprindă două inspecţii sanitare veterinare clinice anuale, în conformitate cu cele indicate în partea I.

(4) Cel puţin la una dintre inspecţiile anuale, la fiecare dintre unităţi se prelevează 30 de probe de ţesut de peşte şi/sau lichid ovarian. Probele sunt selectate, prelucrate şi supuse unui examen de laborator în conformitate cu cele prevăzute în partea I cap. II şi IV.

(5) Programul de inspecţii sanitare veterinare trebuie să fie aplicat pentru cel puţin 4 ani în toate unităţile din zonă sau într-o unitate dintr-o zonă neagreată, destinată să fie agreată.

(6) Pentru ca un program să fie recunoscut oficial, nu trebuie să se producă sau să fie detectat nici un caz de SHV sau NHI, nici ca infecţie clinică, nici în urma unei izolări virale.

PARTEA a IV-a
Titrarea destinată verificării sensibilităţii culturilor celulare la infecţie

Art. 23. - Procedurile recomandate pentru titrarea la care se face referire în partea I cap. III art. 12 sunt prezentate în continuare.

Art. 24. - Este necesar să se utilizeze cel puţin două tulpini de virus SHV şi o tulpină de virus NHI. Tulpinile trebuie să fie reprezentative pentru principalele tulpini virale din Uniunea Europeană, de exemplu, în ceea ce priveşte virusul SHV, o tulpină patogenă provenind de la păstrăvul curcubeu din apă dulce şi o tulpină patogenă din mediul marin pentru calcan, iar în ceea ce priveşte virusul NHI, o tulpină patogenă pentru păstrăvul curcubeu provenind din Europa. Este necesar să se utilizeze tulpini virale bine definite provenind din statele membre ale Uniunii Europene.

Art. 25. - Tulpinile de referinţă sunt disponibile în laboratoarele de referinţă ale Uniunii Europene pentru bolile peştilor.

Art. 26. - Loturile de virus având un număr redus de pasaje pe culturi celulare sunt cultivate în flacoane de culturi celulare pe liniile BF2 sau RTG2 pentru virusul SHV şi pe linia celulară EPC pentru virusul NHI. Trebuie să se utilizeze un mediu de cultură la care să se adauge cel puţin 10% ser fetal. Este necesar să se utilizeze un indicator MOI, iar raportul dintre numărul de particule virale infecţioase ce se adaugă la un număr cunoscut de celule dintr-o cultură să fie sub 1.

Art. 27. - Atunci când efectul citopatic este total, virusul din supernatant este colectat prin centrifugarea culturilor celulare la 2000 x g pentru 15 minute, sterilizat prin filtrare printr-un filtru de membrană de 0,45 žm şi distribuit în criotuburi notate. Virusul este păstrat la o temperatură de -80oC.

Art. 28. - La o săptămână după îngheţare 3 criotuburi cu câte o tulpină virală fiecare sunt dezgheţate în apă rece şi titrate pe liniile celulare sensibile. Cel puţin la fiecare 6 luni, sau dacă susceptibilitatea liniilor celulare se bănuieşte că a scăzut, fiecare tulpină virală este dezgheţată şi titrată.

Art. 29. - Procedura de titrare trebuie să fie descrisă în detaliu pentru ca aceeaşi procedură să fie urmată de fiecare dată.

Art. 30. - Titrarea prin diluţie limită trebuie să cuprindă cel puţin 6 replicări de fiecare serie de diluţie. Titrurile sunt comparate cu titrurile obţinute anterior. Dacă titrul uneia dintre cele 3 tulpini virale scade cu un factor de 2 log sau mai mult, în raport cu titrul iniţial, linia celulară nu mai trebuie să fie utilizată în scop de supraveghere.

Art. 31. - Dacă liniile celulare sunt conservate în laborator, fiecare linie trebuie să fie examinată separat.

Art. 32. - Registrele cu evidenţele de laborator trebuie să fie păstrate cel puţin 10 ani.

PARTEA a V-a
Acronime şi abrevieri


BF2 Bluegill fry (linie celulară)
ECP Efect citopatic
CRL Laborator de referinţă al Comunităţii Europene pentru bolile peştilor
ELISA Test imunoenzimatic
EPC Epithelioma papulosum cyprini (linie celulară)
FHM Fathead minnow (linie celulară)
FITC Fluorescein izotiocianat
Hepes Acid N-2-hidroxietilpiperazină-NŐ-2-etan sulfonic
HRP Peroxidază din hrean
IF Imunofluorescenţă
IFAT Test de imunofluorescenţă indirectă
NHI Necroza hematopoietică infecţioasă
NPI Necroza pancreatică infecţioasă
MEM Mediu minim esenţial
MOI Multiplicity of infection (raportul dintre numărul de particule virale infecţioase adăugate la un număr cunoscut de celule din cultură)
OPD Ortho phenilen diamine
PBS Tampon fosfat salin
RTG2 Rainbow trout gonad (linie celulară)
RT-PCR Reversed transcriptase polymerase chain reaction
Tris-HCI Tris-hidroximetil-aminometan-HCI
TRITC Tetrametil-rodamin-izotiocianat
SHV Septicemia hemoragică virală

Art. 33. - Anexele nr. 1, 2 şi 3 fac parte integrantă din prezenta normă sanitară veterinară.

Miercuri, 23 septembrie 2026, 07:41

Declinare de raspundere: Informaţiile publicate în aceasta rubrică, precum şi textele actelor normative nu au caracter oficial.